高师生物化学实验个案教材设计及教法探讨———聚丙烯酰胺凝胶电泳法

生物化学实验课程是生命科学学院的一门必修课程。教学计划安排生物化学实验30学时，在有限和时间内，怎样保证实验内容具有基础性、实用性的时代性，让学生有更多的动手实践的机会?近年来我们在教材的编写及课堂教法中做了一些探讨。下面以聚丙烯酰胺凝胶电泳为例介绍如下。聚丙烯酰胺凝胶电泳实验是生物化学实验中的基础性实验，具有实用性和时代性。但原教材中将其列为(演示实验)。为了让学生能亲自动手做这一实验，我们将其改为学生必做实验。首先分析学生原有理论知识：已学习了蛋白质的两性解离、等电点、酶、同工酶、电泳等理论知识。在操作部分，电泳仪和电泳槽的使用已学习(醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白)。再分析原教材，整个实验要经过3大步骤：制备凝胶—电脉—染色。难点是凝胶的制备(要制备分离胶和浓缩胶)，耗时较多但又能改动的步骤是：1、3步。分析了本实验学生的知识背景及本实验特点后，根据认知学习理论提出有关教学理论[2～5]，设计了本实验。在克服花时较多的特点上，在两处进行了改动：制胶时，只做分离胶，不做浓缩胶。经实验证明，这样的条件下也能达到分离效果。另外，分离材料上也进行了改动，将原来分离蛋白质改为分离过氧化物酶同工酶，因过氧化物酶染色时间较短，紫红色的酶带便于观察。为达到本实验教学目标，在实验设计上设计了10个栏目，从多角度，多方位提供有关信息，为学生激活原有知识，同化新知识，过渡到智慧技能，并使学生养成自学及终身学习的习惯，提供微环境。下面将本实验的设计教案介绍如下：
1 教学目标
1.1 掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳法的基本原理。
1.2 掌握凝胶的制备过程、电脉仪及电泳槽的连接、电流的调节，取胶、染色等操作技术。
1.3 了解此项技术的应用。
2 相关理论知识点酶P90　同工酶P97　蛋白质PIP30　电泳P31　基因表达P271
3 实验原理聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的具三维网状结构的凝胶，具有“分子筛"和电泳双重效应，分辨率高。水稻幼芽过氧化物酶同工酶的等电点均小于pH8.6，在此条件下，它们均带负电荷，在电场中向正极移动。因同工酶所带电荷、分子量及形状的差异，经过一定时间电泳后，可将它们分离开。用联苯胺-过氧化氢染色液染色，可得到蓝紫色同工酶谱。
4 仪器试剂
4.1 仪器电泳仪(600V)及盘状电泳槽。电泳玻璃管(用碱性较低的玻璃管)，内径5～7mm，长80～100mm。长滴管、试管架(制胶时用来垂直插放玻璃管)、试管、微量注射器或微量吸管、带长针头的注射器、带有玻璃珠或玻璃棒的一小段乳胶管、乳胶段(红1cm)。
4.2 试剂
4.2.1 样液：水稻幼芽(或其他植物性材料)200mg，加入1mL提取液，研磨，离心10min，3000rpm，上清液滴入几滴40%的蔗糖，1～2滴溴酚蓝指示剂，备用。
4.2.2 凝胶液A液(pH8.9)100mL溶液中含1mol/LHCl48.0mL，Tris36.6gTEMED0.23mL。B液 100mL溶液中含Acr28.0g，Bis0.75g。C液 100mL溶液中含过硫酸铵0.14g。
4.2.3 电极缓冲注液(pH8.3)Tris6.0g，甘氨酸28 8g，加水到1000mL，用时稀释10倍。
4.2.4 染色液 醋酸—联苯胺溶液1mL(2g联苯胺溶于18mL冰醋酸中，加水至72mL)；3%过氧化氢(0.4mL，加水至20mL临用前配制)。注：试剂中Acr———丙烯酰胺Bis———亚甲基双丙烯酰胺TEMED———四甲基乙二胺Tris———三羟甲基氨基甲烷。
5 实验操作
5.1 制胶取一支洁净玻璃管，一端用带有乳胶管的小段玻棒塞住，插在试管架上。取一洁净三角瓶，按A液∶B液∶蒸馏水∶C液=1∶2∶1∶4(V/V)的比例混合，轻轻摇均。用长滴管加混合液至玻管内约9cm高，上端用滴管小心滴加蒸馏水约1cm高，静置约20min。当水层与凝胶液间出现一界面时，凝胶聚合完毕。将凝胶管下端的乳胶管玻棒塞去掉，水层用吸水纸吸去。
5.2 安装电泳槽凝胶管的上端抹一点水，使之润滑，套上乳胶段，旋转插入上槽孔内。将上槽放到下槽架上，调节凝胶管的高度，使凝胶管下端低于下槽。下槽加入电极缓冲液，用滴管赶凝胶下端气泡。上槽加入电极缓冲液，用滴管赶凝胶上端气泡。
5.3 加样用进样器吸取样品，每根凝胶管用微量进样器加入样液80uL。
5.4 电泳连接电泳槽和电泳仪，上端接负极，下端接正极。插上电源，打开电泳仪，选择稳压。刚开始时，调节电压50V，5min后调至200V。电泳约1.5小时，指示剂移动到距凝胶管正极端约1cm处，停止电泳。关闭电泳仪开关，取下电源插头。打开电泳仪盖子，将上槽取出，逐根取下凝胶管。
5.5 取胶注射器吸入一定量的水，将针头插入凝胶(非上样端)与玻管壁之间，并紧贴管壁，一面注入水，一面慢慢旋转玻管并推针前进，靠水流压力和润滑作用，使凝胶从玻管中脱落，退出针头，将凝胶装入试管内。
5.6 染色加入染色液，浸泡整条胶。染色约7～10min，有蓝紫色酶带出现，倒去染色液，加入自来水。
5.7 画出酶谱